研究日本腦炎病毒蛋白誘導細胞凋亡機制; Study on apoptosis induced by Japanese encephalitis virus proteins

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題名:	研究日本腦炎病毒蛋白誘導細胞凋亡機制;Study on apoptosis induced by Japanese encephalitis virus proteins
作者:	許素連;Su-Lian Shiu
貢獻者:	中國醫藥大學：醫學檢驗生物技術學系碩士班
關鍵詞:	細胞凋亡;Apoptosis
日期:	2007-07-12
上傳時間:	2009-08-12 17:09:59 (UTC+8)
摘要:	日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，簡稱JEV）是一種藉由蚊子傳染的黃質屬病毒主要會入侵神經系統，引起急性腦膜炎並使腦、腦膜和脊髓受損。本篇研究目的在於探討日本腦炎病毒與誘導HL-CZ及TE671細胞凋亡（apoptosis）現象的關係以及特定病毒蛋白是否也能引發細胞走向細胞凋亡的途徑，及其分子機制為何。首先，利用propidium iodide染劑染色發現，HL-CZ及 TE-671細胞在MOI為1的日本腦炎病毒感染48小時後，細胞明顯有細胞凋亡的現象。隨後利用質體DNA重組選殖以及細胞轉染技術，建立個別獨立表現日本腦炎病毒蛋白E、NS1、NS2B、NS3-180、NS2BNS3-180、NS4A及NS4B的細胞株。再利用PI染劑、Annexin V染色、Fluorimetric assay kit，確認病毒蛋白NS2B、NS3-180、NS2BNS3-180表現細胞會產生細胞凋亡。進一步藉由西方墨點法發現，表現病毒非結構蛋白NS2B、NS3-180 及NS2BNS3-180的HL-CZ細胞株，caspase 3、8蛋白被活化；而細胞表現病毒蛋白NS2BNS3-180有活化caspase 3、8、9蛋白的現象產生。表現病毒結構蛋白E以及非結構蛋白NS3-180、NS2BNS3-180的TE-671細胞株， caspase3、9有被活化的現象。最後利用DioC6染劑染色，表現病毒蛋白E 的HL-CZ細胞株有粒線體膜電位下降的趨勢；藉由FLUO3/AM染劑測得細胞表現NS2B3-180促使細胞內鈣離子釋放；利用DCFH-DA染劑得知表現NS2B的TE-671細胞株有活性氧化物的產生；而當細胞表現病毒蛋白NS2B3-180時，發現活性氧化物生成和粒線體膜電位下降。此研究成果將有助於更加了解日本腦炎病毒誘導細胞凋亡的分子傳遞路徑。 Japanese encephalitis virus (JEV), a mosquito-borne flavivirus, causes severe neurological diseases with a high fatality rate. In this study, the goal of this study is to characterize JEV-induced apoptosis, to identify the dominant viral protein involved in apoptosis, and to investigate the molecular pathways of JEV protein-induced apoptosis. Flow cytometric analysis revealed apoptosis of HL-CZ and TE-671 cells infected with JEV at a MOI of 1 after 2-day infection. Propidium iodide staining, Annexin-V staining and fluorimetric assay of caspase-3 indicated that JEV proteins E, NS2B, NS3, and NS2b-NS3 protease induced apoptosis of HL-CZ and TE-671 cells, respectively. Western blotting showed that single expression of NS2B, NS3-180, and NS2BNS3 protease activated caspases 3 and 8 in HL-CZ cell. Active form of caspases 3 and 9 were detected in JEV E, NS3-180, and NS2BNS3 protease -expressing TE-671 cells, while active form of caspase 9 was only found in NS2b-NS3 protease-expression HL-CZ cell. In addition, the increase of ROS was measured in NS2B-, and NS2b-NS3 protease –expressing TE-671 cells. The decrease of MMP was measured in E –expressing HL-CZ cells and NS2b-NS3 protease-expression TE-671 cells. The increase of Ca2+. was measured in NS2b-NS3 protease –expressing HL-CZ cells. This study provides more information on the mechanism of the JEV induced apoptosis.
顯示於類別:	[醫學檢驗生物技術學系暨碩士班 ] 博碩士論文

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