發炎反應在急性腎臟損傷與慢性腎病變的角色

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Title:	發炎反應在急性腎臟損傷與慢性腎病變的角色 The role of inflammation in acute kidney injury and chronic kidney disease
Authors:	游棟閔;Tung-Min Yu
Contributors:	臨床醫學研究所博士班
Keywords:	發炎激素;急性腎臟損傷;chemokines;acute kdiney injury
Date:	2015-11-12
Issue Date:	2017-03-22 14:19:11 (UTC+8)
Publisher:	中國醫藥大學
Abstract:	背景與目的：發炎反應在各種腎臟疾病包括急性腎臟損傷與慢性腎病變都扮演一定程度的角色。本研究主題主要探討免疫發炎反應在急性腎臟損傷與慢性移植腎病變兩者腎臟病變所造成不良的影響，期望能找出改善預後的方法。急性腎臟損傷(acute kidney injury)是?床上十分常?的併發症。除了各種內科疾病原因所造成之外，亦是各種外科手術時常見的併發症之一。其中，特別是在腎臟移植手術後造成移植腎功能異常重要的原因之一。愈來愈多的研究證據指出，急性腎臟損傷後產生的發炎反應與急性腎臟損傷狀況的嚴重程度有密切關係，常使急性腎臟損傷的情況惡化無法恢復，並進展至慢性腎衰竭。除此之外，在其他腎臟病變原因中包括慢性腎絲球炎或腎臟移植後的慢性移植腎病變，都與免疫發炎反應有密切的關聯性。在我們相關系列的研究中發現，在慢性移植腎病變的病例中，發炎巨噬細胞的多寡和活化狀況與移植腎組織間質的纖維化和腎小管的萎縮程度，呈現明顯的相關性，並影響了移植腎長期的存活率。此結果已發表於歐洲腎臟醫學期刊。本研究主要探討急性腎臟缺血後續引發的免疫發炎反應對急性腎臟損傷的影響。急性腎臟缺血後再灌? (ischemia-reperfusion; I/R)的情況是造成急性腎傷害相當重要的致病機轉之一。而缺血後再灌?所引起的急性腎臟損傷時常被發現合併明顯的免疫發炎反應。缺血後再灌?期的傷害比缺血期更明顯，常會從血流中帶入大量的活化發炎細胞，造成原來組織細胞更大的傷害。同時發炎細胞亦會釋放各種發炎激素增強擴大發炎傷害。過去的研究指出缺血後所出現的發炎反應對於腎臟功能的惡化有相當程度的影響。細胞化學趨素(Chemokines) 具有化學趨性，透過免疫細胞本身相關的接受器(receptors)，密切影響各種類的免疫細胞功能。目前研究已經清楚的知道白血球在遷移的過程中包含了幾個重要步驟(firm adhesion、shape change、 spreading、transmigration )皆分別受到各種細胞化學趨素的作用。在各類腎臟疾病當中，文獻報告有關於細胞化學趨素(Chemokines)的研究，最早是在一些慢腎絲球腎炎產生的發炎反應，目前有關於細胞化學趨素對於急性腎臟缺血後再灌?的研究有限。 RANTES 對於各類白血球的移動具有明顯的作用。在相關缺血性疾病包括急性心肌梗塞、腦中風等，RANTES 的角色已被證實。但是在急性缺血後腎臟組織傷害(post-ischemia acute kidney injury) 的研究目前闕如。本研究目的在於探討 RANTES 對於急性缺血後腎臟組織傷害所扮演的角色，並且使用RANTES基因剔除小鼠比較缺血後對腎臟組織傷害的影響。材料和方法：使用雄性, 6-8週齡的C57BL / 6 和RANTES -/- 基因剔除小鼠。兩側腎動脈用止血鉗夾35分鐘。各組均以厚?3μm的?片進?實驗，腎臟組織?片經過處?後，使用免疫組織化學染色方法進?各種發炎細胞指標的測量比較。並以Quantitative real-time PCR 分析腎臟組織中各種cytokine/chemokine的表現?。此外，使用腎小管細胞 (NRK-52E) 接受無氧測試模擬腎小管缺血的狀況，進一步探討腎小管細胞產生RANTES 可能的機轉。將NRK-52E 細胞株置入無氧箱，於 6, 16小時後，檢測 RANTES 的蛋白質量和檢測 NF-?B轉錄因子的DNA結合活性。並使用NF-kB 抑制劑，分析RANTES 的蛋白質量。另外，將HK-2 與HK-2 cells know-down (sh-HIF-1α) 細胞經過低氧處理後，分析 LncRNA 的變化 (using Human Disease-Related LncRNA Profiler ；CAT# RA920D, System Biosciences)。並使用生物資料庫(RNA hybrid)挑選出具有與RANTES相結合潛力的LncRNA。結果：野生種小鼠經過兩側腎動脈手術後發現，腎臟缺血組織經免疫組織化學染色法呈現明顯RANTES 陽性反應。而且其陽性反應主要集中於腎小管細胞，最顯著的時間為手術後的第三天。與野生種小鼠相比，各種免疫發炎細胞的染色包括中性白血球、巨嗜細胞、淋巴球等，RANTES 基因剔除小鼠的腎臟組織在手術後，呈現明顯的減少，並達到有意義的差異。當進一步分析相關的細胞發炎激素包括 IL-6、TNF-α、IL-1時發現，RANTES 基因剔除小鼠的腎臟組織，經手術後，亦同時呈現較低度的發炎現象。測量腎功能(serum creatinine) 與腎小管壞死(acute tubular necorsis)指標呈現相同趨勢的變化，並達到有意義的差異。另外將腎小管細胞 (NRK52E) 經過低氧處理後，RANTES蛋白質的表現量隨著曝露低氧時間的增加，呈現正向的增加。當加入NF-kB 抑制劑時，與對照組相比，RANTES蛋白質的量，明顯減少達到有意義的差異。而將HK2腎細胞置於低氧處理後，經由reporter assay實驗發現，PRINS (Psoriasis susceptibility-related RNA Gene Induced by Stress)於缺氧狀態中，會經由HIF-1α影響HK2細胞產生RANTES。結論：綜合上述實驗的結果，我們認為 RANTES 參與急性腎臟缺血再灌注後所引起的發炎反應。腎小管主要為分泌RANTES的腎臟組織，並且經由NF-?B 轉錄因子途徑，參與腎小管受到缺氧時，產生RANTES的過程。再者，研究中發現LncRNA-PRINS可能參與調控腎小管產生RANTES的過程，其引起的後續發炎反應，在急性腎臟缺血性損傷中可能扮演一定程度的角色。 RANTES (Regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted), recruits circulating leukocytes and augments inflammatory responses in many clinical conditions. Inflammatory responses in ischemia-reperfusion injury (IRI) significantly affect the unfavorable outcomes of acute kidney injury (AKI), and that infiltrating immune cells are important mediators of AKI. However, significance of RANTES in AKI and whether hypoxia-induced LncRNAs are involved in regulatory process of AKI are not known. Here we show that, in kidney IRI mice model, significant RANTES expression was observed in renal tubular cells of wild type mice. RANTES deficient (RANTES-/-) mice showed better renal function by reducing the acute tubular necrosis, serum creatinine levels, infiltration of inflammatory cells and cytokine expressions compared to wild type. In vitro, we found that RANTES expression was regulated by NF-κB. Further, renal tubular cells showed deregulated LncRNA expression under hypoxia. Among HIF-1α dependent LncRNAs, PRINS (Psoriasis susceptibility-related RNA Gene Induced by Stress) was significantly up regulated in hypoxic conditions and had specific interaction with RANTES as confirmed through reporter assay. These observations show first evidence for RANTES produced by renal tubular cells act as a key chemokine in AKI and HIF-1α regulated LncRNA-PRINS might be involved in RANTES production. Altogether, HIF-1α-LncRNA-PRINS-RANTES axis might play a novel role in AKI.
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