| 摘要: | 近幾十年來罹患過敏性氣喘的病患急遽增加，在台灣也有逐年增加的趨勢，全球每年死於氣喘的人口也超過二十萬人。此外、全球每年約花費40億美元來開發治療氣喘的藥物。然而、氣喘病患若無持續服用類固醇、抗組織胺、抗白三烯素等治療氣喘之藥物，其復發率也會隨之增加。本實驗之目的在於針對抑制早期第二型 T 輔助型細胞 ( T Helper cell ) 所誘導之發炎反應來控制晚期症狀。
我們將實驗分為體外實驗 (in vitro) 及體內實驗 (in vivo) ：
在體外實驗 (in vitro) 中，我們利用 EL4 T cell cell line ，給予各濃度紫草素 （0.003 μM 、 0.01 μM 、 0.03 μM 、 0.1 μM 、 0.3 μM） 及蘇木素（0.1 μM 、 0.3 μM 、 1 μM 、 10 μM 、 30 μM） ，30分鐘後給予 PMA 和 cAMP 刺激其 IL-4 及 IL-5 ，經過24小時後，分別利用 trypan-blue exclusion assay 、酵素連結免疫分析方法 (Enzyme-linked immunoabsorent assay ; ELISA) 、即時定量聚合酶鏈反應 (real-time PCR) 等方式來計算藥物對於細胞之毒殺性，以及第二型T輔助型細胞 ( T Helper cell ) 所誘導之發炎反應中相關細胞激素，及上游轉錄因子其蛋白質與 mRNA 表現量。
體外實驗 (in vitro) 中，利用上述各濃度紫草素 （0.003 μM 、 0.01 μM 、0.03 μM 、 0.1 μM 、 0.3 μM） 及蘇木素 （0.1 μM 、 0.3 μM 、 1 μM 、 10 μM 、 30 μM） 對於 EL4 T cell 並沒有細胞殺性，且 IL-4 及 IL-5 蛋白質及 RNA 的表現，並呈現劑量關係。再進一步分析其相關訊息傳遞因子的表現，利用 real-time PCR來偵測其mRNA表現量，發現調控 TH2 相關的轉錄因子 GATA3 及 c-Maf 有明顯的抑制並呈現劑量關係，且不影響 TH1 相關的轉錄因子 T-bet mRNA表現。
在體內實驗 (in vivo) 中我們將氣喘小鼠作為實驗模式並利用氣管滴入的方式(intratracheal installation) 分別給予高 (4.32 μg/mouse) 、低劑量 (0.432 μg/mouse) 之紫草素與高 (428 μg/mouse) 、低劑量 (42.8 μg/mouse) 蘇木素再利用鼻腔吸入 (intranasal) 連續給予 OVA (albumin) 三天，而後犧牲老鼠，並偵測其肺泡沖洗液 (bronchoalveolar lavage fluid) 中發炎細胞如嗜伊紅性白血球 (Eosinophils) 、細胞激素、化學趨化激素表現量且將肺臟組織利用H&E stain觀察其發炎細胞是否有減少浸潤到肺部，最後測量老鼠肺部呼吸道阻力。
在體內實驗 (in vivo) 中氣喘小鼠模式中給予高劑量 (21.6 mg/mouse) 及低劑量 (21.6 mg/mouse) 之紫草素與高 (2.14 mg/mouse) 、低劑量 (214 μg/mouse) 蘇木素其肺泡沖洗液 (bronchoalveolar lavage fluid) 中細胞激素 IL-4 ， IL-5 ，及化學趨化激素 Eotaxin 均有抑制現象且發炎細胞也有相同抑制反應。在老鼠肺臟組織 H&E stain 中給予紫草素及蘇木素之老鼠其肺部發炎細胞有減少的趨勢。此外、測量老鼠其呼吸道阻力也同樣隨著藥物劑量增加而減少。因此，本實驗發現在氣喘小鼠身上給予高低劑量之紫草素與蘇木素均會減少並降低其氣喘所引起之第二型 T 輔助型發炎反應、我們並且持續偵測其肺組織中 TH2 轉錄因子 GATA-3 、 c-Maf ，及 Th1 轉錄因子 T-bet mRNA 表現量以及利用病理切片利用 PAS stain 及 masson’s trichrome 染色法觀察其黏素 (Mucus) 及膠原蛋白 (Collagen) 等相關導致肺纖維化之前趨物質；發現紫草素及蘇木素確實會明顯減少及抑制氣喘小鼠肺部中過敏性發炎現象。
關鍵詞：紫草素、蘇木素、第二型T輔助細胞、過敏性氣喘。
Asthma patients has dramatically increased during the past decade years. Medicines for asthma such as inhaled corticosteroid, anti-histamine or anti-leukotriene, can rescue the late phase symptom but reappear without taking. Inhalation of corticosteroid showed side effects. Therefore, it needs to develop the drug of asthma. Shikonin and brazilin are two components of Chinese herbal medicines, isolated from Lithospermum erythrorhizon and Caesalpinia sappatin L. Shikonin has been reported to treat macular eruption, measles, sore-throat and burns and brazilin has been used to treat chronic intestinal inflammation, amenorrhea and Enterorrhagia. We choose shikonin and brazilin to investigate the therapeutic effects on allergic asthma in vitro and in vivo. EL4 T cell treated with different doses of shikonin（0.003 μM, 0.01 μM, 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3μM）and brazilin（0.1 μM, 0.3 μM, 1 μM, 10 μM, 30 μM）combined with PMA and cAMP to induce T helper 2 (TH2) cytokines release. We analyzed T helper 2 (TH2) cytokines by ELISA and transcription factors mRNA expression by real-time PCR. We also investigated the therapeutic effects of shikonin and brazilin in a murine asthma model. We found that different doses of shikonin and brazilin have no cytotoxicity by trypan-blue exclusion and could dose-dependently reduce TH2 cytokines (IL-4, IL-5) expression and GATA-3 and c-Maf expression. We also found that shikonin and brazilin could inhibit TH2-specific transcription factors mRNA but not TH1 transcription factor (T-bet) mRNA. Shikonin and brazilin inhibited antigen–induced bronchial alveolar fluid (BALF) IL-4, IL-5 and eotaxin expression, reduced eosinophils cells infiltration in BALF and lungs, and airway hyperresoseiveness(AHR). Our study suggested that shikonin can effectively suppressed TH2 cytokines release in vitro and inhibited allergic inflammation and airway hyperresponsiveness in a murine model of asthma.
Key words: shikonin, brazilin, type II T helper cell, allergic asthma. |
