防己類藥材之品質評估及其指標成分之分析方法研究 研究生 鄧正賢 中國醫藥學院中國藥學研究所 摘 要 防己為常用中藥，具有利尿止痛的功用。在臺灣除了使用馬兜鈴科(Aristolochiaceae)植物廣防己Aristolochia fangchi Y.C. WU ex L.D. CHOW et S.M. HWANG的根部外，尚使用防己科(Menispermaceae)植物粉防己Stephania tetrandra S. MOORE之根或根莖，木防己Cocculus trilobus (THUNBERG) DE CANDOLLE的根部，其它還有許多替代品或膺偽品充斥其中。 馬兜鈴酸(aristolochic acid)是馬兜鈴屬(Aristolochia)植物的主要成分，臺灣市售的馬兜鈴屬植物最常見的有廣防己(Aristolochia fangchi Y.C. WU ex L.D. CHOW et S.M. HWANG)及關木通(Aristolochia manshuriensis KOMAROW)，其他馬兜鈴屬的藥材還有馬兜鈴、天仙藤、青木香，而馬兜鈴藥材的原植物為馬兜鈴科北馬兜鈴(Aristolochia contorta BUNGE)或馬兜鈴(Aristolochia debilis SIEBOLD et ZUCCARINI)的成熟果實，天仙藤藥材則為其地上藤莖部分，青木香藥材則為其乾燥根。 1993年比利時發生了因服用含防己減肥處方而造成腎衰竭的病例，被懷疑與其所含的馬兜鈴酸成分有關，馬兜鈴酸具增強免疫功能及抗腫瘤功效，已開發用於臨床，然因有報告指出馬兜鈴酸具有誘變性為致癌因子及懷疑與比利時中草藥腎病(CHN)有關，故引起社會大眾的疑慮，進而引起國內外對含馬兜鈴酸藥材的重視。故本研究進行防己類藥材生藥組織鑑別，評估防己類藥材藥理作用與毒性差異，並建立馬兜鈴酸、粉防己鹼的分析方法。 臺灣防己市場品經抽查北中南三十七家中藥房，其販售名稱極為混亂，有漢防己、木防己、廣防己等名稱，經形態外觀及顯微鑑定確認三十三家使用廣防己(Aristolochiae Fangchi Radix)，四家使用粉防己(Stephaniae Tetrandrae Radix)；而根據七家中藥廠提供的防己藥材經確認五家使用粉防己(Stephaniae Tetrandrae Radix)，一家使用青藤(Sinomenii Caulis)，並發現有一家中藥廠使用茶茱萸科(Icacinaceae)的瘤枝微花藤(Iodes sequinii (HEMSLEY) REHDER)充當防己使用。 薄層層析法方面，指標成分馬兜鈴酸其展開溶媒為氯仿：乙醇：乙酸乙酯＝17：3：1，以U.V. 254 nm檢視之，單味藥材如廣防己、粉防己、木防己、青藤、瘤枝微花藤、關木通、川木通、天仙藤、青木香，均可鑑定出是否含有馬兜鈴酸。方劑中馬兜鈴酸的薄層層析，其中組成較少的方劑，具明顯對應馬兜鈴酸I標準品的斑點；組成較複雜的方劑，僅具較模糊對應馬兜鈴酸I標準品的斑點，故常會誤判，改進方法為盡量增加點注量的濃度，並以可見光判讀，馬兜鈴酸可呈亮黃色斑點而加以區別。指標成分粉防己鹼的薄層層析法，展開溶媒為正己烷：乙酸乙酯：二乙胺＝5：4：1，以U.V. 254 nm檢視之，粉防己鹼於Rf值約0.40處有褐色斑點，若噴以呈色劑Dragendorff''''s reagent下呈橘黃色斑點，可明顯鑑別。 高效液相層析法方面，建立了馬兜鈴酸、粉防己鹼的分析方法，包括單味藥材或濃縮製劑均可適用，並發展直接萃取法、酸鹼萃取法、固相萃取法前處理樣品。在分析馬兜鈴酸指標成分時，本法採用C18逆相層析管柱，移動相為乙?/2 % 醋酸水溶液(45：55, v/v)，流速為0.8 mL/min，檢測波長為395 nm；分析粉防己鹼指標成分時，移動相為甲醇/乙?/0.06%二乙胺水溶液(60：20：20, v/v/v)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為242 nm。比利時減肥處方及防己、木通、馬兜鈴、天仙藤、青木香及其所含濃縮方劑 (包括防己黃耆湯、防己茯苓湯、木防己湯、疏經活血湯、上中下通用痛風丸、小續命湯、養血壯筋健步丸、辛夷散、導赤散、消風散、龍膽瀉肝湯、八正散、當歸四逆湯、八味帶下方、馬兜鈴湯、補肺阿膠散、天仙藤散、青木香丸)，以直接萃取法、酸鹼萃取法、固相萃取法前處理樣品，再以上述高效液相層析法分析，得到良好的分析結果。 在防己類藥材之毒性實驗方面，急性毒性試驗顯示廣防己對小鼠半數致死量(LD50)為16.94 g/kg，木防己為16.03 g/kg，粉防己為4.99 g/kg；慢性毒性試驗結果顯示廣防己組給藥二週後BUN、creatinine值即開始上升，顯示廣防己具有腎毒性，六個月後腎臟切片僅見腎小管萎縮，卻未見中草藥腎病另一特徵間質細胞纖維化，粉防己組則在給藥一週後肝功能不正常，sGOT、sGPT顯著上升，四週後引起肝臟局部硬化壞死，可見在大劑量長期給藥下，廣防己傷腎，粉防己傷肝，而在本試驗中未見馬兜鈴酸引起的典型中草藥腎病(CHN)之腎臟間質纖維化。 在防己類藥材之鎮痛、抗發炎、利尿實驗方面，鎮痛試驗結果顯示各種防己均有提高痛閾的作用，其中以廣防己之鎮痛效果最好；在大鼠足蹠浮腫試驗中，各種防己均有明顯的抗浮腫作用，其中以粉防己的抗浮腫效果最好，而在N-formyl-Met-Leu-Phe誘發中性白血球(Neutrophil)釋放發炎物質的抑制反應中，粉防己在濃度30 mg/mL、100 mg/mL下對β-glucuronidase的釋放則有明顯的抑制作用。在利尿試驗方面，各種防己對大鼠並無明顯的利尿效果(粉防己小劑量微增，大劑量反有抑制)。 粉防己鹼對藥物誘發肝損傷的治療實驗中，低劑量粉防己鹼對於a-?異硫氰酸酯(ANIT)及四氯化碳(CCl4)所誘發之急性肝毒性具治療作用，但對乙醯酚胺(APAP)所導致肝毒性則有毒性加成作用；粉防己鹼其傷肝實驗中，低劑量粉防己鹼對肝臟無毒性，高劑量粉防己鹼則具肝毒性，且N-acetyl-L-cysteine對粉防己鹼誘發的肝毒性具保護作用，可見粉防己鹼的肝毒性與體內耗盡Glutathione(GSH)量有關。 綜合本研究結果，臺灣防己市場品雖然經過比利時中草藥腎病(CHN)事件後仍以廣防己(Aristolochiae Fangchi Radix)為主，並首次在臺灣發現以茶茱萸科(Icacinaceae)的瘤枝微花藤(Iodes sequinii (HEMSLEY) REHDER)充當防己使用。而防己類藥材均有鎮痛、抗發炎作用，但在大劑量長期給藥下，廣防己傷腎、粉防己傷肝，而N-acetyl-L-cysteine對粉防己鹼誘發的肝毒性具保護作用；本研究並建立指標成分馬兜鈴酸(aristolochic acid)、粉防己鹼(tetrandrine)的簡單、快速、靈敏的分析方法。; Quality Evaluation of Fang-Ji and Analysis of Marker Constituents Jeng-Shyan Deng Institute of Chinese Pharmaceutical Sciences China Medical College Abstract Aristolochiae Fangchi Radix is the dried root of Aristolochia fangchi Y.C. WU ex L.D. CHOW et S.M. HWANG (Aristolochiaceae) which promotes diuresis and relieves edema, dispells wind and dampness and relieves pain. The Fang-Ji available in Chinese medicine, includes not only Aristolochia fangchi (Aristolochiaceae), but also Stephania tetrandra S. MOORE, Cocculus trilobus (THUNBERG) DE CANDOLLE and Sinomenium acutum REHDER et WILSON (Menispermaceae). There are many substitutes that have been used to replace Fang-Ji, some of which are also counterfeits. Aristolochic acid (AA) is the major component of Aristolochia sp. Some of the species in Aristolochia are commonly used in traditional Chinese medicines, such as Aristolochia fangchi, Aristolochia
