中文摘要 肝細胞在受到如病毒、酒精或氧化緊迫持續傷害後，會由正常的肝細胞轉形成肝腫瘤細胞。肝癌形成與一般腫瘤一樣，可區分為initiation、promotion及progression三個階段，而promotion為一可逆且時序很長的時期，因此成為瞭解及延緩癌化進程的重要時段。Tumor promotion與體外培養之細胞轉形很相近，而由實驗室及前人之研究認為activator protein 1（AP-1）的活性對於tumor promotion及oncogenesis的進程而言，都是相關的。AP-1已知可調控細胞生長、分化及細胞凋亡，且許多造成腫瘤形成及細胞轉形的基因，都受到AP-1的調控。12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate（TPA）是為人熟知的腫瘤促進劑，其可活化AP-1的活性，且可使老鼠上皮細胞JB6轉形，因此本章藉由TPA分析AP-1的活性是否為肝細胞轉形所必須。由anchorage-independent transformation assay結果得知，Chang/AP-1和HepG2/AP-1重組細胞在以TPA處理下，可觀察到細胞轉形的情形。藉由luciferase assay及electrophoretic mobility shift assay（EMSA）得知，TPA的確可以在肝細胞中活化AP-1，並且增加AP-1與DNA結合之能力。利用Western blotting及訊息傳導抑制劑分析TPA的訊息傳導路徑，結果顯示TPA主要是經由mitogen-activated protein kinases（MAPK）中ERKs訊息傳導路徑活化AP-1。MEK抑制劑─PD98059或AP-1抑制劑-retinoic acid，皆可抑制由TPA所誘發之肝細胞轉形。以上結果顯示AP-1活性是肝細胞轉形時所必須的，所以是否能藉由抑制AP-1的活性進而抑制細胞轉形便成為以下實驗所要求證的主要目標。我們選定兩大類藥物進行分析，一為類似於類固醇結構的皂素類（saponin），其可能結合至glucocorticoid receptor而影響AP-1 complex；另一為具有抗氧化能力和調控MAPK訊息傳導路徑的黃酮類（flavonoid）。我們將測試這兩類藥物是否會干擾AP-1的活性，進而抑制肝細胞轉形。 屬於皂素類的甘草素（glycyrrhizin），在臨床上已證實具有抗發炎、抗潰瘍、抗過敏及抗腫瘤等療效。為了瞭解glycyrrhizin抗腫瘤的分子機轉，我們觀察細胞在正常血清及TPA處理之下調控AP-1活性的情形。由Chloramphenicol acetyltransferase（CAT）assay及EMSA實驗結果得知，glycyrrhizin確實可以活化上游具有AP-1/TATA的promoter，並且呈現濃度效應，而且在HepG2及Vero細胞中，都可以發現相同的結果，顯示glycyrrhizin對於AP-1的影響與細胞種類無關。另外由不同promoter─AP-1/TATA、AP-1/None及None/TATA，分析glycyrrhizin對其影響。結果發現glycyrrhizin可活化含有AP-1的promoter，顯示glycyrrhizin是藉由活化AP-1而調節CAT的表現。進一步的研究發現，glycyrrhizin於細胞在血清或TPA處理之下，對AP-1有不一樣的調節。Glycyrrhizin在細胞處理血清的情況下，會活化AP-1的活性，而在細胞處理TPA的情況下，則會抑制AP-1的活性。因此glycyrrhizin對AP-1的活性呈現不同的調控現象，這是否代表glycyrrhizin在不同情況下會扮演細胞增生及抑制腫瘤轉形的雙重角色呢？仍值得進一步探討。 黃酮類（flavonoid）多存在於食物如水果、酒當中，目前已知有些黃酮類可能藉由MAPK調控基因的表現。因此我們搜尋五大類共24種黃酮類，依其結構分為flavonols（包括quercetin、rutin、hyperin、kaempferol、morin、galangin、silibinin、3-hydroxyflavone）、flavones（包括baicalein、baicalin、chrysin、luteolin、apigenin、flavone）、flavanones（包括hesperetin、hesperidin、eriocitrin、naringenin、naringin）、flavanols（包括(+)-catechin、(-)-epicatechin）及isoflavones（包括gentisin、puerarin、formononetin）。首先針對五大結構分析在TPA存在下調控AP-1的情形，由luciferase assay顯示，flavonols及flavanols的結構，能抑制AP-1的活性，flavones及isoflavones能活化AP-1，而flavanones則沒有明顯的活化或抑制現象。再依其取代基的不同，分析能抑制AP-1活性的flavonols，發現其在C3位置如以OSugar基進行取代時，會比由OH基取代有更明顯的抑制情形。因此黃酮類調控AP-1的效應與其特定結構相關。進一步針對兩種黃酮類進行更深入的研究，第一種為屬於flavonols的morin，其可藉由減少p38 kinases蛋白質磷酸化的量，抑制AP-1的活性及肝細胞的轉形。第二種為屬於isoflavones的formononetin，其可藉由增加p38 kinases蛋白質磷酸化的量，活化AP-1的活性，但經p38 kinases所活化的AP-1活性並不會加成肝細胞的轉形。 因此在本論文中呈現肝細胞轉形的分子機轉及療程設定的可能，也證實不同藥物可在肝細胞轉形階段產生效應。未來希望併合這些用藥，在不同型式的動物模式中，測試其對肝癌生成的抑制作用，也希望在不久的將來能將其應用至人體試驗上，以期能降低肝癌的發生率及死亡率。; Abstract Hepatocellular transformation is a long-term process that requires chronic exposure to the harm of virus, alcohol or oxidative stress. Activator protein 1 (AP-1), a nuclear transcription factor, consists of Jun/Fos heterodimer or Jun/Jun homodimer, and its transactivation is required for tumor promotion. AP-1 is an immediate early protein which plays important roles in the neoplastic transformation, cell proliferation, differentiation, and inflammation. Carcinogenesis is divided into three stages of initiation, promotion, and progression. Promotion is a reversible and rate-limiting stage in the process of carcinogenesis. Previous studies indicated that the tumor promoter-12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)-induced AP-1 activity is required for neoplastic transformation in JB6 cells. To analyze whether the AP-1 activity is essential for TPA-induced hepatocellular transformation, the anchorage-independent transformation assay was carried out. TPA promoted the formation of anchorage-independent colonies in hepatocytes, indicated that TPA could induce hepatocellular transformation. Additionally, TPA induced the AP-1 activity and enhanced the DNA-binding ability of AP-1 by luciferase assay and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). To further analyze the signal transduction pathway involved in TPA-induced AP-1 activity, the mitogen-activated protein kinases (MAPK) inhibitor a
